Tài nguyên dạy học

Hỗ trợ trực tuyến

  • (ththanh2008@yahoo.com)

Điều tra ý kiến

Bạn thấy website này có hữu ích với chuyên môn và công việc của bạn không?
Rất hữu ích
Hữu ích
Bình thường
Không hữu ích

Thống kê

  • lượt truy cập   (chi tiết)
    trong hôm nay
  • lượt xem
    trong hôm nay
  • thành viên
  • Ảnh ngẫu nhiên

    Word-logo Slide0 Word-logo Word-logo Word-logo Word-logo Slide0 Word-logo Word-logo Word-logo Pdf Word-logo Xls Word-logo Slide0 Word-logo

    Thành viên trực tuyến

    0 khách và 0 thành viên

    Chào mừng bạn đến với website của Bùi Thanh Long. Hy vọng rằng đây sẽ là nơi để bạn học tập và chia sẻ dữ liệu cũng như kinh nghiệm của bản thân. Hãy cho đi để nhận được nhiều hơn! Xin cảm ơn bạn đã ủng hộ cho website này!

    Quý vị chưa đăng nhập hoặc chưa đăng ký làm thành viên, vì vậy chưa thể tải được các tài liệu của Thư viện về máy tính của mình.
    Nếu chưa đăng ký, hãy nhấn vào chữ ĐK thành viên ở phía bên trái, hoặc xem phim hướng dẫn tại đây
    Nếu đã đăng ký rồi, quý vị có thể đăng nhập ở ngay phía bên trái.

    CNSHDV: Tái lập trình nhân tế bào tạo tế bào gốc Pluripotent

    (Tài liệu chưa được thẩm định)
    Nguồn:
    Người gửi: Bùi Thanh Long (trang riêng)
    Ngày gửi: 08h:17' 12-04-2010
    Dung lượng: 2.0 MB
    Số lượt tải: 16
    Số lượt thích: 0 người
    SEMINAR
    CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
    TÁI LẬP TRÌNH NHÂN BẰNG CÁC NHÂN TỐ XÁC ĐỊNH
    NHẰM TẠO TẾ BÀO PLURIPOTENT
    Thực hiện: Bùi Thanh Long.
    Lớp: ĐVH – K17
    Giáo viên giảng dạy: TS. Trần Quốc Dung.
    CẤU TRÚC BÀI BÁO CÁO
    PHẦN I. MỞ ĐẦU
    PHÂN II. NỘI DUNG
    1. Các nhân tố xác định
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent
    3. So sánh phương pháp sử dụng nhân tố xác định với các phương pháp khác.
    PHẦN III. KẾT LUẬN
    TÀI LIỆU THAM KHẢO

    PHẦN I: MỞ ĐẦU
    Tế bào gốc phôi hứa hẹn là nguồn cung cấp tế bào cho các liệu pháp cấy ghép tế bào, có thể trong tương lai được sử dụng để điều trị các bệnh khác nhau và thương tích. Tuy nhiên, như trong trường hợp cấy ghép nội tạng, từ chối miễn dịch sau khi cấy ghép là một vấn đề vướng mắc với loại trị liệu này. Hơn nữa, việc sử dụng các phôi người hiện nay gặp phải những khó khăn nghiêm trọng về mặt đạo đức. Những vấn đề này có thể được khắc phục nếu tế bào pluripotent được tạo ra từ các tế bào soma của bệnh nhân. Có 3 phương pháp khác nhau nhằm tạo tế bào pluripotent từ tế bào cơ thể là: phương pháp chuyển nhân, phương pháp dung hợp tế bào và phương pháp tái lập trình nhân bằng các nhân tố xác định. Trong phạm vi của bài tiểu luận này chỉ xin đề cập đến phương pháp thứ 3: Phương pháp tái lập trình bằng các nhân tố xác định.
    PHẦN I: MỞ ĐẦU
    Hình 1: Các phương pháp tái lập trình nhân tế bào soma
    Phần II: Nội dung
    1. Các nhân tố xác định
    Thực tế là nhân tế bào soma có thể được tái lập trình bằng cách chuyển vào tế bào trứng hoặc dung hợp với các tế bào gốc phôi, điều này đòi hỏi tế bào trứng và tế bào gốc phôi phải chứa nhân tố phục hồi. Các nhân tố phục hồi này có thể tương tác với nhau để duy trì khả năng tạo tế bào pluripotent trong các tế bào gốc phôi. Dưới đây là một số nhân tố thường được sử dụng trong việc tái lập trình nhân tế bào.
    Phần II: Nội dung
    1.1. Oct3/4 (POU5F1).
    POU5F1 là một yếu tố phiên mã thuộc nhóm POU, đặc biệt là trong các tế bào gốc phôi,phôi sớm và các tế bào mầm, và thường được lựa chọn là Oct3 (Okamoto et al 1990) hoặc Oct4 (Scholer et al. 1989). Vô hiệu hóa Oct3/4, phôi sẽ chết trong tử cung của con cái mang (Nichols et al. 1998), mặc dù các phôi này có thể đạt tới giai đoạn phôi nang, nuôi cấy in vitro các khối nội bào của hợp tử chỉ làm thay đổi sản phẩm của phôi nang thành dòng dưỡng bào, và Oct3/4 biến các tế bào ES biệt hóa thành các dưỡng bào, trong khi đó các tế bào đối chứng có mặt Oct3/4 lại có thể duy trì trạng thái tế bào gốc pluripotent (Niwa et al. 2000). Tương tự như vậy, vô hiệu hóa Oct3/4 bằng siRNA trong tế bào ES người làm cho những tế bào này biệt hóa thành dòng dưỡng bào (Zaehres et al. 2005). Ngược lại, tăng Oct3/4 lên gấp đôi trong các tế bào ES gây ra sự biệt hóa thành nội bì và trung bì nguyên thủy (Niwa et al 2000). Do đó, hàm lượng Oct3/4 rất quan trọng, quyết định số phận của các tế bào trong các tế bào ES.
    Phần II: Nội dung
    1.2. Sox2
    Sox2 là một yếu tố phiên mã thuộc nhóm Sox (SRY-related HMG-box) có trong các tế bào ES, phôi sớm, các tế bào mầm và tế bào gốc thần kinh. Vô hiệu hóa Sox2, phôi sẽ chết ở giai đoạn phát triển ngoại bì nguyên thủy (Avilion et al 2003). Hợp tử có thể phát triển thành phôi nang với hình thái bình thường, nhưng các tế bào chưa phân hóa không tăng lên khi phôi nang được nuôi cấy in vitro, và chỉ có lớp dưỡng bào và nội bì nguyên thủy được tạo ra. Phá vỡ Sox2 ở các tế bào ES chuột bằng cách loại trực tiếp có điều kiện hoặc RNAi dẫn đến sự biệt hóa rất nhanh (Ivanova et al. 2006; Masui et al 2007). Những dữ liệu này chứng minh rằng Sox2 là không thể thiếu đối với việc duy trì khả năng tạo ra tế bào pluripotent trong cả phôi sớm và các tế bào ES. Một protein thuộc nhóm Sox khác, Sox15, cũng có hàm lượng cao trong các tế bào ES, nhưng vai trò của nó vẫn chưa được đánh giá rõ ràng (Maruyama et al 2005).
    Phần II: Nội dung
    1.3. Nanog
    Nanog là một protein homeobox, đặc biệt có mặt trong các tế bào pluripotent và bên trong khối tế bào của phôi giai đoạn phôi nang (Chambers et al 2003; Mitsui et al 2003). Vô hiệu hóa Nanog phôi bị phá vỡ các tổ chức mô ngoài phôi tại E5.5, không thể thấy rõ lá mặt hoặc ngoại bì nguyên thủy (Mitsui et al 2003). Thiếu Nanog phôi nang vẫn có hình thái bình thường, nhưng khối nội bào chỉ tạo ra các tế bào nội bì đỉnh và không có các tế bào có nguồn gốc từ ngoại bì khi phôi nang được nuôi cấy in vitro. Tế bào ES có thể thiếu Nanog, nhưng chúng có xu hướng biệt hóa thành dòng nội bì ngoài phôi ngay cả khi có mặt của LIF (yếu tố ức chế bệnh bạch cầu). Một nhóm khác báo cáo rằng ngay cả với dị hợp tử Nanog cũng làm cho các tế bào ES không ổn định, dễ bị tổn thương và tự động phân hóa (Hatano et al. 2005).
    Phần II: Nội dung
    RNAi-mediated loại bỏ Nanog đã dẫn tới sự biệt hóa đối với cả tế bào ES ở chuột (Hough et al. 2006; Ivanova et al 2006) và người (Hyslop et al. 2005; Zaehres et al. 2.005). Quan trọng hơn, sự có mặt của Nanog ở các tế bào ES chuột cho phép các tế bào này tự đổi mới khi không có LIF. Tương tự như vậy, sự có mặt của Nanog trong tế bào ES người kích hoạt sự tăng trưởng mà không có dưỡng bào nào (Darr et al 2006). Ngoài ra, sự có mặt của Nanog trong tế bào ES cho thấy hoạt động tái lập trình tăng lên rõ rệt sau khi dung hợp với các tế bào soma (Silva et al 2006). Sự biểu hiện của Nanog được điều hòa bởi Oct3/4 và Sox2 (Kuroda et al. 2005; Rodda et al. 2005; Wu da & Yao 2005) và bị ngăn chặn bởi p53 (Lin et al 2005), GCNF (Gu et al. Năm 2005) và TCF3 (Pereira et al 2006). Phân tích gen kết tủa kháng nguyên trên nhiễm sắc thể chứng minh rằng Oct3/4, Sox2 và Nanog chia sẻ nhiều gen đích ở tế bào ES ở cả chuột và người (Boyer et al. 2005; Loh et al. 2006).
    1.4. c-Myc
    c-Myc là một yếu tố phiên mã mở khóa helix-loop-helix/leucine (chuổi leucine xoắn – vòng – xoắn) liên kết với protein của chính nó, Max. c-Myc được điều hòa bởi STAT3 (Kiuchi et al. năm 1999) và đóng vai trò quan trọng trong việc tự đổi mới và duy trì khả năng tạo tế bào pluripotent ở các tế bào ES chuột (Cartwright et al, 2005): sự biểu hiện ổn định của c-Myc gây ra tự làm mới của các tế bào ES chuột mà không cần LIF, trong khi đó, các dạng trái ngược của c-Myc gây ra sự biệt hóa ngay cả khi có mặt của LIF. GSK3β điều hòa ngược hoạt động của c-Myc bằng cách phosphoryl hóa phụ thuộc vào sự suy giảm của proteasome (Sears et al, 2000). Vì vậy, c-Myc là một mục tiêu chung cho cả LIF và tín hiệu dẫn đường Wnt. c-Myc gắn trong hệ gen ở nhiều vị trí khác nhau (Fernandez et al . 2003; Li et al. 2003; Cawley et al. năm 2004) đã cho chúng ta ý tưởng làm thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể (Knoepfler et al 2006) và kích hoạt sự biểu hiện của một số miRNA (O`Donnell et al 2005).
    Phần II. Nội dung
    1.5. Klf4
    Klf4 là một nhân tố phiên mã Kruppel-like (còn được gọi nhân tố gut-enriched Kruppel-like, GKLF) (Rowland et al 2005). Ban đầu được xác định là một nhân tố ức chế khối u trong các bệnh ung thư đường tiêu hóa (Zhao et al. 2004; Wei et al, 2005). Một mô hình loại bỏ có điều kiện có vai trò hỗ trợ cho Klf4 trong bệnh ung thư đường tiêu hóa (Katz et al 2005). Tuy nhiên, Klf4 biểu hiện quá nhanh trong ung thư tế bào biểu bì hình vảy và bệnh ung thư vú (Foster et al 1999, 2000). Hơn nữa, sự cảm ứng của Klf4 trong keratinocytes là cơ sở ngăn chặn sự chuyển đổi giữa 2 quá trình phân chia và biệt hóa và bắt đầu chứng loạn sản tế bào biểu bì hình vảy (Foster et al, 2005). Vì vậy, Klf4 được kết hợp với việc ức chế khối u và sự phát sinh ung thư. Biểu hiện lạc vị trí của Klf4 ngăn cản sự tăng nhanh số lượng tế bào, nhưng nếu chỉ cắt bỏ một trong các gen đích của nó, p21, là đủ để trung hòa hiệu ứng kìm hãm tế bào của Klf4. Trong tế bào đã loại bỏ p21, Klf4 tiến hành sự gia tăng tế bào bằng cách điều hòa p53 (Rowland et al 2005). Điều này có thể là một lý do giải thích cho chức năng kép của Klf4 trong các bệnh ung thư.
    Ngoài những biểu hiện của nó được biết đến ở đường tiêu hóa, tinh hoàn và da, người ta còn tìm thấy Klf4 biểu hiện cao trong các tế bào ES chuột chưa biệt hóa (Tokuzawa et al 2004). Người ta cũng đã thấy STAT3 bất hoạt trong tế bào ES chuột làm giảm một cách đột ngột sự biểu hiện của Klf4 và sự kìm hãm biểu hiện của Klf4 cho phép sự tự đổi mới không phụ thuộc vào LIF (Tokuzawa et al 2004). Một kết quả nghiên cứu khác cũng cho biết hiệu quả tích cực của Klf4 trong sự tự đổi mới của các tế bào ES chuột (Li et al 2005), và Klf4 đã được biết đến như là một yếu tố kết hợp với Oct3/4 và Sox2 để kích hoạt lõi promoter Lefty1 (Nakatake et al. 2.006).
    Phần II. Nội dung
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
    Để thử nghiệm các nhân tố kích hoạt khả năng tạo tế bào pluripotent, các nhà khoa học đã phát triển một hệ thống trong đó khả năng tạo tế bào pluripotent có thể được phát hiện bằng sự biểu hiện của gen chỉ thị. Fbx15 được biểu hiện một cách đặc biệt trong các tế bào ES và phôi sớm, nhưng không cần cho sự tự đổi mới và phát triển của các tế bào ES (Tokuzawa et al. 2003). Họ đã chèn β-geo (một sự kết hợp của gen kháng β-galactosidase và neomycin) vào locus Fbx15 ở chuột bằng cách tái kết hợp tương đồng. Các tế bào ES từ hợp tử tương đồng có β-geo (Fbx15βgeo/βgeo) đã được đề kháng với một nồng độ cực cao của G418 (lên đến 12 ml mg -1), trái lại các tế bào soma của chuột có nguồn gốc từ Fbx15βgeo/βgeo đã nhạy cảm với sự lựa chọn này. Do đó, nó vẫn có thể xảy ra ngay cả với sự cảm ứng cục bộ của khả năng tạo tế bào pluripotent cũng làm cho các tế bào soma kháng G418 ở nồng độ bình thường (0,3 mg ml-1).
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
    Họ đã đưa thêm yếu tố MEFs vào gen Fbx15βgeo/βgeo bằng vector retrovirus và nuôi cấy chúng trong tế bào ES với môi trường có chứa G418. Với bất cứ yếu tố đơn lẻ nào, cũng không thu được khuẩn lạc kháng G418. Tuy nhiên, bằng cách kết hợp bốn yếu tố (Oct3/4, Sox2, c-Myc và Klf4), họ đã thu được nhiều khuẩn lạc kháng G418. Các tế bào này giống như các tế bào ES cả về hình thái và khả năng phân chia. Hơn nữa, khi cấy vào tế bào trần của chuột, các tế bào gốc pluripotent (iPS) được tạo ra có chứa mô sẹo của tất cả ba lá mầm. Do đó, các tế bào pluripotent có thể được tạo ra từ nguyên bào sợi chỉ bằng việc sử dụng một vài yếu tố xác định (Takahashi & Yamanaka 2006).
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
    Các tế bào iPS với lựa chọn Fbx15 không góp phần tạo ra dòng mầm hoặc trưởng thành, cho thấy sự tái lập trình của chúng chỉ xảy ra cục bộ. Gần đây, Các nhóm nghiên cứu báo cáo rằng đã cải thiện đáng kể chất lượng của các tế bào iPS (Maherali et al. 2007; Okita et al. 2007; Wernig et al 2007). Cả ba nhóm nghiên cứu đều sử dụng bốn yếu tố như nhau, nhưng Nanog được sử dụng như là một yếu tố chỉ thị. Các tế bào iPS với lựa chọn Nanog cho thấy nhiều mẫu gen đã biểu hiện tương tự như trong các tế bào ES hơn khi lựa chọn Fbx15. Các tế bào iPS được cải thiện này cũng đã góp phần tạo ra dòng mầm và trưởng thành. Những dữ liệu này cho thấy nếu kết hợp chính xác bốn yếu tố thì có thể tạo ra các tế bào pluripotent không hề khác biệt so với các tế bào ES.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
    Sử dụng bốn yếu tố nào để tạo ra tế bào pluripotent vẫn là một câu hỏi khó trả lời. Trong mô hình của Yamanaka và cộng sự thì c-Myc đóng vai trò rất quan trọng. Như là một gen giả ung thư mạnh, c-Myc góp phần vào sự gia tăng nhanh chóng của các tế bào iPS. Ngoài ra, bằng cách gắn vào nhiều vị trí của bộ gen và bổ sung các phức hợp histon acetylase, c-Myc sẽ làm mở các nhiễm sắc thể (Adhikary & Eilers 2005). Tuy nhiên, biểu hiện của một mình c-Myc trong nguyên bào sợi sẽ khiến apoptosis hoặc thoái hóa phụ thuộc vào p53. Nhóm nghiên cứu đã chủ trương dùng Klf4 để vô hiệu hóa hiệu ứng bất lợi của c-Myc bằng cách trấn áp p53. Sau đó Oct-3/4 và Sox2 được gắn đến các vị trí mục tiêu của chúng và nhằm tạo tế bào pluripotent bằng cách tăng cường gen stemness và gen trấn áp sự biệt hóa. Gần đây Niwa và cộng sự cho thấy Klf4 cũng có chức năng như một đồng nhân tố của Oct-3/4 and Sox2 (Nakatake et al 2006).
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.1. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 4 yếu tố
    Tuy nhiên, hiện nay chúng ta vẫn không biết liệu bốn yếu tố này có thể tạo ra các tế bào iPS từ các tế bào soma của người hay không. Có thể bổ sung các yếu tố để tạo ra các tế bào iPS của người, nhưng cần thêm nhiều nghiên cứu để xác định có hay không trường hợp này. Ngoài ra, việc sử dụng các vectơ retrovirus và các gen giả ung thư c-Myc đặt ra mối quan tâm về sự an toàn phải được giải quyết trước khi áp dụng đối với các tế bào iPS của người trong y học tái tạo. Trong thực tế, chúng tôi thấy rằng khoảng 20% các con chuột bắt nguồn từ việc lựa chọn Nanog có các tế bào iPS phát triển khối u (Okita et al 2007). Vì thế, cần loại bỏ các c-Myc của retrovirus trước khi ứng dụng lâm sàng.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Tái lập trình các tế bào soma của chuột và người thành tế bào pluripotent, đã có thể thành công với bốn yếu tố là: Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4. Xem xét sự có mặt không đúng chỗ của c-Myc là nguyên nhân gây ra khối u ở thế hệ con cháu thứ 2 và bản thân các retrovirus có thể xen vào các gen gây đột biến, các thế hệ của tế bào iPS được tạo ra với một số lượng tối thiểu của các yếu tố có thể đẩy nhanh các ứng dụng lâm sàng của phương pháp này. Người ta đã nhận thấy rằng tế bào gốc thần kinh trưởng thành ở chuột thể hiện mức Sox2 và c-Myc nội sinh cao hơn tế bào gốc phôi, và Oct4 ngoại sinh cùng với Klf4 hoặc c-Myc là đủ để tạo ra các tế bào iPS từ tế bào gốc thần kinh. Những tế bào iPS được tạo ra từ hai yếu tố tương tự như tế bào gốc phôi ở mức độ phân tử, đã góp phần vào việc phát triển của dòng mầm, và các mẫu biến dị. Cá nhà khoa học đề xuất rằng, trong việc tạo ra tế bào iPS, số yếu tố tái lập trình có thể được giảm xuống khi sử dụng các tế bào soma với mức độ biểu hiện nội sinh của các yếu tố được bổ sung phù hợp.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Các tế bào soma của chuột và người có thể được lập trình lại thành tế bào iPS thông qua sự biểu hiện của một tập hợp các yếu tố xác định (Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4, cũng như Nanog và LIN28 của người). Có thể tạo ra các tế bào iPS từ nguyên bào sợi của chuột và người khi không có c-Myc của retrovirus, và do đó có ý kiến cho rằng biểu hiện nội sinh của c-Myc có thể có một vai trò trong quá trình tái lập trình. Tế bào gốc thần kinh (NSC) biểu hiện Sox2 nội sinh, có thể có chức năng trong việc duy trì tính đa năng của NSCs, và Sox2 đã được đề xuất trong việc duy trì tế bào pluripotent bằng cách điều hòa sự biểu hiện của Oct4. NSCs đã được tạo ra từ việc chuyển gen Oct4-GFP (OG2)/ROSA26 của heterozygous ở não chuột trưởng thành, protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter Oct4 (Oct4-GFP) và chuyển gen lacZ của Escherichia coli từ locus ROSA26 (ROSA26 lacZ). Các NSCs được tạo ra có khả năng tự đổi mới và có tính đa năng.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Ba sự kết hợp khác nhau của ba yếu tố cũng có khả năng tạo ra các tế bào iPS từ NSCs: Oct4, Klf4 và c-Myc (OKM); Oct4, Klf4 và Sox2 (OKS); và Oct4, c-Myc và Sox2 (OMS). Các nhà khoa học đã không thấy có các tập hợp tế bào GFP1 khi kết hợp ba yếu tố mà không bao gồm Oct4. Tập hợp tế bào GFP1 đã được quan sát thấy 1 tuần sau khi cấy truyền với sự kết hợp OKM (Không có Sox2). Tập hợp tế bào GFP1 chỉ được hình thành sau 14-21 ngày với sự kết hợp OKS (không có c-Myc), và đã bị trì hoãn hơn nữa với sự kết hợp OMS (Không có Klf4). Tuy nhiên, các tế bào iPS ba yếu tố OKM, OKS và OMS có biểu hiện gen tương tự trong ESCs, và tất cả các loại tế bào iPS 3 yếu tố đều biệt hóa thành tất cả ba lá mầm. Những kết quả này chỉ ra rằng tế bào iPS ba nhân tố có thể được tạo ra trong sự vắng mặt của Sox2, Klf4 hoặc c-Myc của retrovirus trong NSCs với sự biểu hiện nội sinh của ba yếu tố này.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Tiếp theo họ đã đánh giá khả năng kết hợp hai yếu tố để tạo ra các thế hệ tế bào iPS từ NSCs. Chỉ hai sự kết hợp được thành công trong việc tái lập trình NSCs. Đầu tiên nhóm nghiên cứu đã quan sát thấy tập hợp tế bào GFP1 khi nuôi cấy NSC có nhiễm Oct4 và Klf4 (OK) và 1-2 tuần sau đó ở những NSC có nhiễm Oct4 và c-Myc (OM). Tế bào iPS hai yếu tố OM cho thấy có biểu hiện gen như ESC và góp phần tạo ra ba lớp mầm trong các khối u. Klf4 và c-Myc có thể chức năng mạnh như nhau. Được biết Klf4 có vai trò bất hoạt p53 (cũng gọi là Trp53), gen ức chế khối u, làm cho tế bào không bị hủy diệt; Klf4 cũng kết hợp cùng với protein chuyển tín hiệu gen gây ung thư RASV12 để kích thích sự tăng nhanh số lượng tế bào.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Tương tự, sản phẩm c-Myc của gen theimmortalizing, khi kết hợp với RAS đột biến đã bộc lộ hiệu ứng gây ung thư. Nó đã được báo cáo rằng c-Myc làm tăng hoạt động của telomerase ở NSCs, một cơ chế có thể chịu trách nhiệm về tính bất diệt của NSCs. Bởi vì c-Myc làm tăng tình trạng nổi khối u trong Chimaera pups, các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng các thế hệ tế bào iPS không có c-Myc của retrovirus là một phát hiện đáng kể. Điều quan trọng là việc các tế bào iPS được tạo ra từ NSCs với Oct4 và Klf4 và không có c-Myc đưa chúng ta đến gần hơn các thế hệ của các tế bào iPS phù hợp cho việc cấy ghép.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Nhóm nghiên cứu đã so sánh giữa tế bào iPS hai yếu tố OK với các tế bào iPS bốn yếu tố và ESCs. Vào ngày 14 sau khi gây nhiễm, năm nhóm tế bào GFP1 được tách ra và nhân giống trong điều kiện nuôi cấy ESC, ba dòng tế bào iPS hai yếu tố OK (60%) (B-2, D-7 và F-4) có hình thái không thể phân biệt với ESCs. Không có nhóm nào hình thành từ NSCs gây nhiễm với việc điều khiển virus (MX). Các nhà khoa học đã ước lượng hiệu quả tái lập trình từ số lượng các nhóm tế bào Oct4-GFP1 và tỷ lệ cấy truyền với kiểm soát virus MX-GFP trên NSCs cho tế bào iPS hai yếu tố OK và iPS bốn yếu tố bằng chiều thời gian.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Qua đó, họ tính toán hiệu quả tái lập trình cho NSCs bốn yếu tố là 3,6% và 0,11% đối với các phương pháp tiếp cận hai yếu tố, so với tái lập trình nguyên bào sợi với việc lựa chọn (<0,08%) và không có lựa chọn (0,5%). Tải nạp với tất cả bốn yếu tố có tác động tích cực về thời gian và số lượng các nhóm tế bào GFP1. Phân tích các gen của virus để xác định kiểu gen nhờ phương pháp khuếch đại gen (PCR). Các gen virus của tất cả bốn yếu tố được phát hiện trong các tế bào iPS bốn yếu tố, trong khi các tế bào iPS hai yếu tố OK chỉ chứa gen Oct4 và Klf4.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Tế bào iPS hai yếu tố OK bắt màu rõ với SSEA-1 và alkaline phosphatase, và bộc lộ các mẫu gen chỉ thị ở ESC tương tự như trong các tế bào iPS bốn yếu tố và ESCs. Kết quả định lượng PCR theo thời gian thực (qRT-PCR) chứng minh rằng biểu hiện nội sinh của Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4 trong tế bào iPS hai yếu tố OK là có thể so sánh được với ESCs, và cho thấy sự im lặng của các bản sao virus trong tế bào iPS hai yếu tố OK với sự giảm 1.000 lần sau 30 ngày. Ngoài ra, trong các tế bào iPS bốn yếu tố, mức độ biểu hiện nội sinh cũng tương tự như trong ESCs, và các gen chuyển đã hoàn toàn im lặng. Biểu hiện toàn bộ gen của iPS hai yếu tố cũng tạo thành đám như ESCs và iPS bốn yếu tố. Phân tích biểu đồ tán xạ của vi dàn DNA chứng minh sự giống nhau giữa các tế bào iPS hai yếu tố và ESCs cao hơn sự giống nhau giữa các tế bào iPS hai yếu tố và NSCs. Như vậy, tế bào iPS hai yếu tố (Dòng F-4) dường như rất giống với ESCs chuột ở mức độ chuyển toàn bộ.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Khả năng biệt hóa của tế bào iPS hai yếu tố OK đã được xác nhận bằng cách cho biệt hóa trong ống nghiệm để tạo thành các bộ phận của phôi. Những tế bào này đã hình thành ngoại bì (Tuj1), nội bì (a-fetoprotein) và trung bì (Flk1). Các khối u đều chứa các dẫn xuất của tất cả ba lá mầm và biểu hiện yếu tố đánh dấu của ba lá mầm. Không có khối u nào được hình thành từ các tế bào cho (NSCs). Những dữ liệu này chứng minh rằng tế bào iPS hai yếu tố OK tạo ra một kiểu hình tế bào pluripotent trong ống nghiệm và trong cơ thể.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Để kiểm tra tiềm năng phát triển của chúng, các tế bào iPS hai yếu tố OK đã được nuôi cấy thành phôi giai đoạn 8 tế bào. Các tế bào iPS đã góp phần vào sự hình thành của khối nội bào trong việc phát triển phôi nang. Sau khi chuyển giao phôi nang tạo thành vào con cái mang thai giả, người ta đã thu được 16 phôi sống trên phôi (E) 13.5 ngày, 2 trong số đó cho thấy sự có mặt của tế bào mầm trong mầm tuyến sinh dục, được đánh giá từ sự biểu hiện Oct4-GFP. Nhuộm b-galactosidase (hình dung các tế bào NSC cho mang gen ROSA26 lacZ) từ toàn bộ phôi đã cho thấy rằng trong kết quả tế bào iPS hai yếu tố OK góp phần vào sự phát triển của ba lá mầm. Các thử nghiệm chặt chẽ về tiềm năng phát triển, tập hợp phôi tứ bội (4n) (n5122), kết quả là 2 phôi bị chết (ngừng lại) tại E13.5.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Những dữ liệu này chứng minh rằng các tế bào iPS có thể làm phát sinh tất cả các mô đến giai đoạn cuối cùng của phôi. Trong tập hợp lưỡng bội (2n), PCR kiểu gen cho thấy 2 trong số 13 chimaeras thể hiện rõ các allele Oct4-GFP của các tế bào cho. Để đánh giá xem liệu các tế bào iPS hai yếu tố OK có thể góp phần tạo dòng mầm, chimaeras được giao phối với con cái CD-1. Hai trong số 12 PUPS đã có một alen Oct4-GFP và 1 trong số 12 con chuột đã có một alen lacZ, bởi vì các tế bào cho bắt nguồn từ một con chuột tái tổ hợp không tương đồng (Oct4-GFP1/2ROSA261/2), và chúng cũng đã có gen Oct4 và Klf4. Không thấy có khối u nào được hình thành từ chimaeras trưởng thành và ở chuột F1 21 tuần và 7 tuần tuổi. Phát hiện này chỉ ra rằng tế bào iPS hai yếu tố OK có thể góp phần phát triển đầy đủ chimaera, kết quả là trong thế hệ tiếp theo (F1) của PUPS vẫn còn sống được, và do đó cho thấy rằng tế bào iPS có đặc tính phát triển tương tự như ESCs.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Tóm lại, nghiên cứu này cho thấy rằng Oct4 cùng với hoặc là Klf4 hoặc c-Myc có thể lập trình lại NSCs thành tế bào gốc pluripotent. Đây là sự biểu hiện đầu tiên của một loại tế bào ngoại bì được tái lập trình bằng các yếu tố xác định. Người ta thấy rằng biểu hiện nội sinh của Sox2 cộng với biểu hiện ngoại sinh của hai yếu tố bao gồm cả Oct4 là đủ để tạo ra các thế hệ của các tế bào iPS từ NSCs trưởng thành. Tuy nhiên, thật không phải dễ để giải thích lý do tại sao biểu hiện ngoại sinh của Klf4 hoặc c-Myc vẫn còn cần thiết trong việc tái lập trình, vì những gen này đã được biểu hiện nội sinh trong NSCs.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    NSCs ở người là có sẵn từ dịch sinh thiết của bệnh nhân, và sẽ đặc biệt thú vị khi đánh giá xem liệu chúng có thể được lập trình lại với phương pháp hai yếu tố hiện đang mô tả. Các ứng dụng lâm sàng của phương pháp tái lập trình tế bào là nhiệm vụ tối ưu hóa các phương pháp tiếp cận nhằm phòng ngừa vấn đề gây ra bởi các gen đột biến của retrovirus chèn vào. Các tác nhân biến đổi nhiễm sắc thể, chẳng hạn như trichostatin A và 5-aza-29-deoxycytidine, gây ra sự biểu hiện thoáng qua của một số gen kết hợp để tạo tế bào pluripotent, bao gồm cả Oct4 và Klf4. Điều này cho thấy rằng một hoặc nhiều yếu tố tái lập trình có thể được thay thế bằng các hợp chất hóa học và trong cách nhìn nhận này, hai yếu tố phiên mã tái lập trình cảm ứng là một mô hình có tiềm năng lớn.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Hình 2: Thế hệ tế bào iPS 2F OK từ NSCs trưởng thành có chuyển gen OG2/ROSA26 của chuột.
    Phân tích RT-PCR và qRT-PCR các yếu tố trong NSCs và ESCs.
    Phân tích Western blot 4 yếu tố trong NSCs và ESCs.
    Hình thái tb iPS 2F OK 14 ngày sau gây nhiễm
    d,f,g. Hình thái tb iPS 2F OK 30 ngày sau gây nhiễm trong môi trường có MEFs.
    e,h. Hình thái NSCs và tb giả nhiễm 30 ngày sau gây nhiễm.
    i. Thế hệ GFP sau 7, 14, 21 ngày sau khi nhiễm 2 yếu tố OK và 4 yếu tố.
    j. Hiệu quả của tái lập trình tạo ra tb iPS 2F và 4F
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Hình 3: Biểu hiện gen của tb iPS
    Phân tích RT-PCR các gen chỉ thị trong ESCs.
    Biểu đồ nhiệt về sự biểu hiện gen trong các loại tb.
    c,d. So sánh sự biểu hiện toàn bộ gen giữa iPS 2F (F-4) với ESCs và giữa iPS 2F (F-4) và NSCs với vi dàn DNA.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Hình 4: Tb iPS 2F OK (F-4) cho biệt hóa in vitro và in vivo.
    Sự biệt hóa in vitro thành 3 lá mầm. Sau khi hình thành các bộ phận của phôi, phôi được đưa lên màng gelatin và cho biệt hóa trong khoảng 10 ngày. Các TB được nhuộm màu với anti-Tuj1, AFP hoặcFlk1, Nhân được nhuộm với DAPI.
    Các teratoma của TB iPS F-4 chứa cả 3 lá mầm. Khoảng 1,5x106 TB iPS F-4 được cấy vào dưới da chuột. Sau 4 tuần, teratoma được nhuộm màu với haematoxylin and eosin.
    Phần II. Nội dung
    2. Sự kết hợp các nhân tố trong việc tạo tế bào pluripotent.
    2.2. Tạo tế bào pluripotent bằng cách kết hợp 2 yếu tố
    Hình 5: Tiềm năng phát triển in vivo của iPS 2F OK (F-4)
    iPS F-4 phát trển thành phôi năng sau 24h.
    Sự đóng góp của dòng mầm từ tb iPS F-4 vào sự phát triển của phôi bằng biểu hiện của Oct4 – GFP. Các phôi được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 13.5.
    c,d. Phôi được nhuộm màu với X-gal.
    e. Phân tích mô học.
    f. Chuột 8 tuần tuổi được tạo ra từ TB iPS F-4, có màu lông đã được xác định sẵn trong TB iPS F-4.
    g. Phân tích PCR kiểu gen của iPS F-4.
    Phần II. Nội dung
    3. So sánh phương pháp sử dụng nhân tố xác định với các phương pháp khác.
    PHẦN III. KẾT LUẬN
    - Quá trình tái lập trình nhân cần có sự tham gia của các nhân tố xác định. Các nhân tố này có thể là Oct3/4 (POU5F1), Sox2, nanog, STAT3, APC/β-catenin, c-Myc, Klf4…
    - Trong bản thân tế bào đã tồn tại các yếu tố này tuy nhiên chúng gần như không hoạt động.
    - Qua các nghiên cứu thì cần thiết phải kết hợp một số yếu tố mới có thể thực hiện quá trình tái tập trình nhằm tạo tế bào pluripotent từ tế bào soma. Kết quả thành công với việc kết hợp 4 yếu tố Oct4, Sox2, c-Myc và Klf4 (hoặc thay thế bằng nanog, Lin28…) nhưng bắt buộc phải có mặt của yếu tố Oct4. Các nghiên cứu khác cũng đã thu được tế bào pluripotent khi tái lập trình kết hợp hai yếu tố Oct4-Klf4 (OK), Oct4-c-Myc (OM). Sở dĩ kết hợp hai yếu tố này vẫn cho kết quả tốt bởi trong các tế bào NSC có chứa các yếu tố nội sinh.
    PHẦN III. KẾT LUẬN
    - Hiện nay, các nhà khoa học đã và đang tiếp tục nghiên cứu trên chuột và người và đã có những tín hiệu khả quan về khả năng tạo ra tế bào pluripotent từ các tế bào gốc trưởng thành, các tế bào soma đặc biệt là các dòng sinh thiết tế bào của chính người bệnh nhằm chống lại phản ứng miễn dịch trong liệu pháp cấy ghép.
    TÀI LIỆU THAM KHẢO
    1. Danwei Huangfu, Rene Maehr, Wenjun Guo, Astrid Eijkelenboom, Melinda Snitow, Alice E Chen & Douglas A. Melton - Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds- Nature Biotechnology Volume 26 number 7 July 2008. (P.795 – 797).
    2. Kazutoshi Takahashi, Koji Tanabe, Mari Ohnuki, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Kiichiro Tomoda, and Shinya Yamanaka - Induction of Pluripotent Stem cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors - Cell 131, November 30, 2007. (P.1–12).
    3. In Hyun Park, Rui Zhao, Jason A. West, Akiko Yabuuchi, Hongguang Huo, Tan A. Ince, Paul H. Lerou, M. William Lensch & George Q. Daley - Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors – NATURE Vol 451, 10 January 2008. (P. 141-147).
    4. Jeong Beom Kim, Holm Zaehres, Guangming Wu, Luca Gentile, Kinarm Ko, Vittorio Sebastiano, Marcos J. Arau´zo-Bravo, David Ruau, Dong Wook Han, Martin Zenke & Hans R. Scho¨ler - Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors - doi:10.1038/nature07061, 8 May 2008. (P.1-5).
    5. Shinya Yamanaka - Pluripotency and nuclear reprogramming – Philosophical Transactions the Royal Society B Biological scienses, 2008 363, (P. 2079-2087).
     
    Gửi ý kiến
    print